Sam Winchester (Padalecki) a fait de son mieux pour échapper à la sinistre histoire de sa famille. Contrairement à son frère aîné, Dean (Ackles), Sam rejeta la quête obsessionnelle de leur père pour mettre à jour les forces du mal qui ont réclamé la vie de la mère des garçons. Afin de mettre autant de distance que possible entre lui et sa famille, Sam quitta la maison tout de suite après le lycée et entra à l'université. Sa nouvelle vie incluait sa belle et aimante petite amie ainsi que l'intention d'entrer à l'école de droit. Dean, cependant, prit une toute autre route, en suivant son père dans les « affaires de la famille ». Quand Dean arriva à la porte de Sam en lui annonçant que leur père avait disparu, Sam n'a eu d'autre choix que de mettre ses plans personnels de côté et de se joindre à Dean.
Après quatre ans de séparation, les frères réunis refont connaissance, et leur rivalité fraternelle est toujours prête à faire surface. Malgré l'étrange enfance qu'ils partagent, ces garçons ont des vues tout à fait différentes du monde. Dean idolâtre toujours son père et, bien qu'il semble souvent arrogant et courageux, il est en fait hanté par la mémoire de la mort violente de sa mère. Sam était trop jeune pour se souvenir de cette affreuse soirée où leur mère mourut et n'accepta jamais de suivre le chemin terrifiant que son père et son frère suivirent.
Un message téléphonique mystérieux de leur père mène les frères Winchester vers un village de Californie marqué par une série de décès inexpliqués. Ils sont rapidement confrontés à la légende locale de la « Dame en blanc », une jolie autostoppeuse qui erre sur les chemins de campagne le soir, conduisant les jeunes hommes à leur perte. Bien qu'ils ne trouvent pas leur père, Dean et Sam découvrent son journal et tentent de déchiffrer ses notes afin de trouver des indices qui les aideront à détruire le spectre.
Une fois le boulot terminé, Sam retourne à l'université mais découvre que la force maléfique qui avait réclamé sa mère, a maintenant pris sa petite amie de la même façon. Pris de rage, de tristesse et de culpabilité, Sam comprend soudainement l'obsession de son père. À l'instar de Dean, Sam est maintenant complètement dédié à la quête de réponses, et, ultimement, à prendre sa revanche.
Liés par la tragédie et le sang à leur mission dangereuse, les frères voyagent des étendues sauvages du Colorado aux terres fertiles du Nebraska et jusqu'aux lacs isolés du Wisconsin, rencontrant des créatures que la plupart des gens croient qu'elles n'existent que dans le folklore, les superstitions et les cauchemars : la terrifiante Bloody Mary, la brutale créature amérindienne connue sous le nom de Wendigo, l'homme au crochet qui chasse les amoureux et les sombres voyageurs fantômes annonciateurs de l'écrasement d'un avion. En suivant les indices du journal de leur père, les frères réalisent qu'il leur a passé les connaissances qu'il a accumulées durant les 20 dernières années. Ce qu'ils n'arrivent pas à comprendre est pourquoi il disparu et les a laissé continuer sans lui.
Prenant sur eux la responsabilité de poursuivre la croisade de leur père, Sam et Dean suivent les enchevêtrements des petites routes mystérieuses du pays, dans leur Chevy Impala '67, à la recherche de leur père et chassant les forces maléfiques surnaturelles qu'ils rencontrent sur leur chemin.